Descripción

El Servicio de Análisis de Proteínas nace para satisfacer las necesidades de los grupos de investigación del IBVF. Fundamentalmente, tiene como misión la identificación de proteínas de interés biológico,  así como la determinación de masas moleculares de péptidos  y  proteínas en solución, mediante espectrometría de masas.

Para ello, cuenta con  diferentes equipos para la preparación y el análisis de las muestras:

- Sistema microrotofor para la separación en solución de hasta 10 fracciones de proteínas en un rango continuo de pH.

- Sistema completo para la separación de proteínas mediante electroforesis bidimensional.

- Scanners (visble y fluorescencia) que permiten la visualización y cuantificación de proteínas en geles. Asimismo, cuenta con la tecnología necesaria para realizar premarcaje de las muestras con fluoróforos diferenciales (DIGE).

Estos equipos están disponible para su utilización por toda persona interesada previa reserva. Los reactivos necesarios correrán a cargo del usuario.

- Sistema  para el recorte automatizado de proteínas en gel de 1 o dos dimensiones

- Sistema para la digestión automatizada de hasta 384 muestras y la preparación  de éstas directamente  sobre la placa de MALDI (desorción láser asistida  por matriz), lo que minimiza notablemente la contaminación con queratinas.

- Espectrómetro de masas con analizador de tiempo de vuelo e ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF).

 

Los análisis ofertados por el servicio son los  siguientes:

- Determinación de masas moleculares de proteínas y péptidos en solución, mediante espectrometría de masas.

Consideraciones sobre la muestra: En función de la masa molecular (del péptido o proteína en cuestión), la concentración necesaria para la medida variará desde algunos femtomoles ( en el caso de peptidos), a cientos de picomoles por ml (en el caso de proteínas grandes), siempre que la disolución esté libre de sales, detergentes  y otros contaminantes que pueden impedir o dificultar la cocristalización de la muestra con la matriz o suprimir la señal en el maldi-tof.

- Identificación de proteínas mediante huella peptídica. Este incluye:

- Digestión enzimática, generalmente con tripsina, de las manchas proteicas a partir de geles de 2-DE o SDS-PAGE (1-D) o proteínas en solución, de forma automatizada o manual. Las manchas proteicas de geles deben contener la menor cantidad posible de acrilamida. En cuanto al grosor de los geles, es aconsejable se encuentre entre 0.75 y 1 mm, y la concentración de acrilamida próxima a 12%. Se debe trabajar con la mayor limpieza posible para evitar la contaminación de las manchas proteicas  con queratinas.

- Análisis  del digerido tríptico mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Para cada proteína, la digestión con tripsina produce un espectro característico y único con diferentes fragmentos trípticos que es lo que se conoce como huella peptídico.

- Comparación de la huella peptídica  experimental con la teórica obtenida “in silico” de todas las proteínas presentes en las bases de datos, y posterior identificación de la proteína. Para que se pueda producir una identificación positiva de una proteína es necesario que su secuencia esté incluida en la base de datos.

Las placas donde se realiza la digestión automatizada de las proteínas contiene 96 pocillos. El tiempo de realización estimado está en función del tiempo que se tarde en rellenar al menos 48 pocillos. Una vez transcurrido dicho tiempo, el tiempo de procesado es de 4-5 días.

Los datos de las proteínas identificadas se suministraran a los usuarios en formato PDF, siendo necesario haber rellenado la correspondiente hoja de servicio suministrada por el técnico.